Thèse soutenue le 14 octobre 2016 pour obtenir le grade de docteur de la Communauté Université Grenoble Alpes

Résumé :
Depuis plusieurs décennies, la méthode de routine employée au laboratoire d'analyses pour le dosage de biomarqueurs sanguins à des fins de diagnostique ou de suivi thérapeutique est la technique enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ^[10]. Cette méthode immunologique consiste à utiliser deux anticorps différents dirigés contre le biomarqueur à doser (méthode ELISA sandwich), le premier étant immobilisé sur un support solide (e.g. microplaque à puits, microbilles) et le second étant couplé à une enzyme permettant la détection spectroscopique grâce à la génération d'un produit coloré. Compte-tenu de la méthode de détection employée, il est nécessaire de séparer les cellules sanguines de la phase liquide constitué par le plasma ou le sérum. Cette étape pré-analytique est réalisée par centrifugation. A partir de ce protocole de référence, des tests immunologiques rapides de type Point-Of-Care (POC) ont été développés pour obtenir des analyses près du patient, simples d'emploi et bas coût, notamment pour les pays en voie de développement. Ainsi, des tests reproduisant en partie le protocole ELISA ont été mis au point par la technique de « lateral flow » sur bandelette ^[6]. La bandelette poreuse intègre un protocole fluidique et biologique complexe (marquage capture lavage pompage). D'autres tests de biologie rapide basés sur l'immuno-agglutination des globules rouges pour la reconnaissance d'antigènes spécifiques ont été étudiés. Ils utilisent des anticorps bispécifiques capables de reconnaître d'une part la cible d'intérêt et d'autre part les globules rouges. Si l'analyte ciblé comporte aux moins deux sites de reconnaissance (ce qui est le cas de tous ceux qui sont dosés par ELISA sandwich), des pontages vont se créer entre cet analyte et les globules rouges via les anticorps bi-fonctionnels, conduisant ainsi à une hémagglutination. Ainsi, la détection rapide (inférieure à 15 min) de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B a ainsi été mise en évidence à partir de 20μL de sang ^[2]. La limite de détection obtenue pour ce test permet d'affirmer que même à relativement faible concentration en analyte, la quantité de globules rouges est suffisante pour permettre une détection par hémagglutination. Sur le même principe, la détection d'anticorps anti-HIV dans le sang total via une protéine bi-fonctionnelle ont permis de montrer une sensibilité et une spécificité du test supérieures à 95% ^{[3, 8]}. Néanmoins, l'ensemble de ces tests ont été réalisés en point final, et leur limite de détection s'avère toujours largement inférieure à celle obtenue par ELISA. Nous proposons dans ce travail de thèse de développer d'un test biologique rapide et sensible par immunoessai. L'objectif principal est de démontrer la faisabilité d'un dosage direct de particules (protéines, virus, micro-organismes, cellules) dans le sang total, grâce à une agglutination des globules rouges, et d'obtenir des limites de détection identiques à celles de l'ELISA. Le principe de base reprend le principe de l'hémagglutination avec l'utilisation d'un anticorps bifonctionnel, mais nous proposons de mettre au point une méthode de détection ultra-sensible basée sur l'imagerie sans lentille ^{[1, 4]}. Une telle détection présente plusieurs avantages. Elle permet d'une part d'être réalisée à l'aide d'un capteur de type CMOS à bas coût, ce qui s'avère indispensable pour le développement d'un test POC. D'autre part, l'imagerie sans lentille permet de réaliser des mesures dynamiques, et donc suivre en temps réel le déroulement de la réaction d'agglutination pour apporter une information quantitative du dosage de l'analyte. Une première partie du travail consistera donc à optimiser la réaction d'agglutination pour permettre son suivi dynamique, et non uniquement une détection en point final. Ces travaux amèneront par ailleurs une simplification importante du protocole d'analyse de l'échantillon sanguin puisque seul un mélange initial de ce dernier avec le réactif bifonctionnel sera requis, apportant par conséquent une simplification radicale du consommable fluidique (un capillaire avec réactif embarqué) et de son instrumentation associée.
^[1] Allier et al. (2010) Biomed Opt Expr 1(3): 762-770
^[2] Chen et al. (2007) Clin Vacc Immunol 14(6): 720-725
^[3] Gupta et al. (2003) J Clin Microbiol 41(7): 2814-2821
^[4] Isikman et al. (2012) Anal Cell Path 35(4): 229-247
^[5] Pingel et al. (2012) Biosens Bioelectron 31(1): 554-557
^[6] Posthuma-Trumpie et al. (2009) Anal Bioanal Chem 393(2): 569-582
^[7] Reisser-Rubrecht et al. (2008) Chem Res Tox 21(2): 349-357
^[8] Shao et al. (2008) Cell Mol Immunol 5(4): 299-306
^[9] Sollier et al. (2010) Biomed Microdev 12(3): 485-497
^[10] Voller et al. (1978) J Clin Path 31(6): 507-520

Mots clés :
Microfluidique, Point-of-care, sang, agglutination, dosage, traitement d'images