​Par Mathilde Aubret
É​quipe Chimie pour la Reconnaissance et l’Étude d’Assemblages Biologiques (CREAB)
CEA-LETI

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de décès dans le monde, et plusieurs biomarqueurs sont utilisés pour diagnostiquer les patients en souffrance cardiaque. La troponine est le biomarqueur de référence pour l’infarctus du myocarde, et l’évaluation de la quantité de troponine dans le sang des patients est cruciale pour les décisions médicales. Les méthodes conventionnelles pour la détection de la troponine et d’autres marqueurs cardiaques sont souvent couteuses et longues, car elles nécessitent de passer par un laboratoire centralisé d’analyses médicales. Les appareils de biologie délocalisée permettent d’effectuer un test sanguin plus rapide au plus près du patient, mais manquent actuellement de sensibilité. Le but de cette thèse est de proposer une méthode terrain innovante pour quantifier les biomarqueurs cardiaques dans le sang et de l’intégrer dans une cartouche placée sur un instrument automatisé et transportable pour la détection haute sensibilité et rapide.
Afin d’améliorer la sensibilité des tests de détection, nous développons une méthode basée sur l’amplification isotherme d’acides nucléiques grâce à une structure oligonucléotidique originale appelée « haltère ». L’échantillon liquide contenant la cible est incubé avec l’halètre qui intègre différents types de sondes moléculaires comme des anticorps ou des aptamères. Ces protocoles de détection complets sont déclinés pour diverses cibles et intégrés sur une plateforme autonome et portable. Cette plateforme comprend des cartouches microfluidiques comportant un réseau de chambres fluidiques permettant de gérer des volumes discrets de fluides. L’architecture de la cartouche est conçue sur la base des protocoles développés et permet d’effectuer chaque étape, depuis le prélèvement sanguin jusqu’au résultat.
Nous avons validé l’amplification isotherme (LAMP) de la séquence haltère intégrant divers types de sondes moléculaires et étudié divers paramètres influant sur l’amplification isotherme pour une meilleure compréhension du processus. Nous avons utilisé la thrombine comme protéine modèle et avons inclus un aptamère spécifique dans la structure haltère. La méthode de détection ainsi développée, nommée aptameroLAMP, est sensible (100 pM) et s’affranchit totalement de l’utilisation d’anticorps. L’application de cette méthode étant limiée à la disponibilité d’un couple d’aptamères, pour le biomarqueur cardiaque troponine, nous avons décliné la méthode avec des anticorps couplés à la structure haltère pour son amplification isotherme. Cette méthode nommée immunoLAMP a été testée avec des plasmas sanguins humains et permet d’atteindre une limite de détection de 100 pg/mL, pertinente pour des dosages physio-pathologiques. Chaque étape de ce protocole de détection complexe a été intégrée dans des cartouches microfluidiques dédiées pilotées par un automate portable. Deux architectures microfluidiques principales ont été développées. La première architecture permet de réaliser les étapes de préparation d’échantillon pour la capture de la cible sur des billes magnétiques. La troponine est détectée dans le plasma jusqu’à une concentration de 1 ng/mL. La seconde architecture propose l’intégration de l’étape LAMP. La cartouche microfluidique est placée sur un système d’actuation thermique, combiné à un système de détection optique pour le suivi de la fluorescence en temps réel. La quantification de l’haltère par amplification LAMP dans cette seconde architecture microfluidique est possible jusqu’à des concentrations de 10 pM.
Cette méthode de détection utilisant la LAMP comme méthode de détection est générique et ouvre de nombreuses perspectives pour son application à d’autres biomarqueurs cardiaques (NTproBNP, miARN…). La technologie microfluidique et l’instrument développé permettront in fine la détection multiplexe de divers biomarqueurs sur cette même plateforme, et devrait permettre l’amélioration du diagnostic des maladies cardiovasculaires.