Par Larry O’Connell
Équipe Chimie pour la Reconnaissance et l’Étude d’Assemblages Biologiques (CREAB)
Dans ce manuscrit, une nouvelle modalité de test de susceptibilité aux bactériophages est proposée. Elle basée sur le suivi par SPR des interactions entre des phages immobilisés et des souches bactériennes.
La SPR est une technique ayant une sensibilité élevée dans le domaine de la profondeur de pénétration d'un champ évanescent (quelques centaines de nanomètres), ce qui nécessite l'immobilisation de sondes à une interface métal-analyte. La culture des phages nécessite la lyse des bactéries hôtes et la génération de grandes quantités de débris qui doivent être séparés des phages avant que des réactions chimiques entrainant leur immobilisation puissent être effectuées. Il convient de noter que cette tâche s'est avérée loin d'être triviale.
Plusieurs méthodes ont été explorées pour la purification du phage gh-1, notamment l'ultrafiltration, l'ultracentrifugation à gradient de densité, la précipitation au PEG et la filtration à flux tangentiel. La comparaison a été effectuée sur la base de facteurs de mérite tels qu'un titre infectieux élevé, une faible agrégation des phages et l'élimination complète des contaminants du lysat de phage. Bien qu'aucune des méthodes mentionnées ne réponde simultanément à tous ces critères, leur combinaison a permis d'obtenir des suspensions de phages très pures et monodispersées tout en conservant leur infectivité.
Une revue de la littérature sur l'immobilisation des phages a mené à la sélection d’un ensemble de stratégies qui ont été explorées pour l'immobilisation des phages sur des substrats en or. Après avoir comparé les résultats de différentes méthodes d'immobilisation, il a été démontré que l’utilisation d’une monocouche auto-assemblée thiolée produisait une couche dense et homogène de bactériophages infectieux sur des substrats à base d’or.
Cette chimie d'immobilisation a ensuite été utilisée pour la micro-implantation de plusieurs phages sur la surface d'un capteur exploitant la SPR pour le suivi parallèle et multiplexé des interactions phage-hôte. Ce capteur SPR a mis en évidence des interactions spécifiques entre le phage 44AHJD et son hôte S. aureus, et entre le phage gh-1 et son hôte P. putida.
Au cours de l'expérimentation, il a été remarqué que le titre des phages chutait de façon inattendue pendant la phase de stockage, ce qui entraînait parfois des échecs dans la culture des phages ou la fonctionnalisation des substrats. Une expérience à grande échelle, sur plusieurs semaines, a été menée pour étudier la cause profonde de ce phénomène. Des mesures complémentaires de comptage de plaques et une analyse de suivi des nanoparticules dans les suspensions de phages ont permis de mieux comprendre la perte multimodale du titre infectieux due à l'adsorption, à l'inactivation et à l'agrégation. Il a été confirmé que celle-ci varie en fonction du matériau constituant le récipient.
Afin d'améliorer la sensibilité de la détection plasmonique, un nouveau capteur SPR a été développé. Il comporte un réseau d'électrodes interdigitées (IDE) intégré pour permettre le transport électrocinétique de masse allant de l'analyte vers la région de détection. Pour produire des réseaux d'électrodes interdigitées sur des prismes SPRi, une nouvelle méthode de prototypage rapide a été mise au point, basée sur l'ablation laser avec un appareil commercial de prototypage de circuits imprimés. L’efficacité du capteur SPR électrocinétique (EK-SPR) ainsi produit a été démontrée pour la détection de S. aureus, en exploitant l'affinité d'un réseau immobilisé de peptides antimicrobiens.