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Lucile Reynaud

Détection de protéines par nanopore fonctionnalisé

Publié le 24 novembre 2020
Thèse soutenue le 24 novembre 2020 pour obtenir le grade de docteur de la Communauté Université Grenoble Alpes - Spécialité : Biophysique

Résumé :
La détection spécifique de protéines est un enjeu majeur dans de nombreux domaines biotechnologiques tels que le diagnostic biomédical ou la compréhension fondamentale des mécanismes d’interaction entre protéines. Les nanopores solides sont des ouvertures de taille nanométriques micro-fabriqués dans des membranes diélectriques fines. Ils sont prometteurs en tant que biocapteurs sensibles pour la détection sans marquages de molécules uniques. Une tension est appliquée de part et d’autre de la membrane, ce qui entraine les biomolécules au travers du pore. Lorsque l’une d’entre elles traverse le nanopore, elle génère un blocage de courant pendant un certain temps, ce qui offre une signature spécifique pour chaque biomolécule d’intérêt. Durant ces travaux de thèse, un procédé en salle blanche a été développé afin de fabriquer des puces avec nanopore. Une autre technique a été d’utiliser un microscope à transmission électronique pour percer des nanopores de 15 nm de diamètre dans des membranes de nitrure de silicium de 20 nm d’épaisseur. Un banc expérimental pour la détection par nanopore a été construit et testé. α-thrombine, ?-thrombine (protéines globulaires de 5 nm de diamètre) et prothrombine (sphéroïde de dimensions 5 nm x 9 nm) sont trois protéines de structures proches impliquées dans la coagulation sanguine. Elles ont été détectées avec un nanopore à une concentration de 1 nM. De plus, prothrombine a été discriminée de α-thrombine et γ-thrombine grâce à sa plus grande taille. A cause de leur taille similaire et donc de la même signature de blocage de courant qu’elles génèrent, α-thrombine et γ-thrombine n’ont pas été discriminée dans ce pore. La surface du nanopore a donc été fonctionnalisée avec des aptamères. Les aptamères sont de courtes séquences d’ADN simple brin capables de se lier avec une grande affinité à des biomolécules. Nous avons choisi un aptamère reconnaissant spécifiquement α-thrombine. La fonctionnalisation a été prouvée grâce à une réduction mesurée du diamètre du nanopore. α-thrombine et ?-thrombine ont des interactions électrostatiques différentes l’une et l’autre avec les aptamères en surface. Nous avons donc pu observer des temps de passage différents dans le nanopore fonctionnalisé entre ces deux protéines et avons pu les discriminer. Les nanopores fonctionnalisés avec aptamères offrent donc des performances prometteuses et polyvalentes en matière de bio-détection. .

Jury :
Rapporteur : Mr Rabah Boukherroub
Rapporteur : Mr Sébastien Balme
Examinateur : Mr Bertrand Fourcade
Examinatrice : Mme Corinne Ravelet
Examinateur : Mr Hubert Girault
Examinatrice : Mme Pascale Pham
Thèse dirigée par Mr Arnaud Buhot et codirigée par Mme Aurélie Bouchet-Spinelli et Mme Camille Raillon

Mots clés :
Nanopore, détection de protéines, aptamères