Par Milagros Quintana
Équipe Chimie pour la Reconnaissance et l’Étude d’Assemblages Biologiques (CREAB)
Universidad Peruana Cayetano Heredia in Lima, Peru
Le criblage d'une bibliothèque d'ADNc de VHH provenant d'alpagas immunisés avec un lysat de cellules T24 (lignée cellulaire de cancer de la vessie humaine surexprimant CD105), avec CD105 soluble par l'exposition sur phage (phage display) et phage-ELISA a permis de trouver 19 VHHs qui se lient à la protéine CD105 humaine, un co-récepteur endothélial de TFG-β impliqué dans la régulation de l'angiogenèse et du développement tumoral. Les ADNc des VHH anti-CD105 sélectionnés ont été amplifiés, séquencés et analysés avec les outils ExPASY, GeneDoc et BLAST. Les dix-neuf séquences présentaient les caractéristiques structurelles typiques d'un VHH et toutes étaient différentes. Les ADNc de VHH ont été sous-clonés du vecteur phagemid pHEN2 dans le vecteur pET22b(+) pour l'expression et la purification des protéines VHH recombinantes par chromatographie d'affinité sur des colonnes d'agarose Ni-NTA. Treize protéines VHH recombinantes ont conservé la capacité de lier CD105 comme déterminé par ELISA. Ces VHH anti-CD105 ont été immobilisés sur des biopuces afin d'évaluer leur spécificité et leur affinité avec le CD105 lié à la membrane des cellules par l ́imagerie de la résonance des plasmons de surface (SPRi). Les données SPRi ont montré que les VHHs se lient aux cellules SC qui surexpriment CD105 à leur surface mais pas ou peu aux cellules THP-1 qui ne le font pas, prouvant ainsi leur spécificité. La moyenne de la variation de la réflectivité SPRi parmi les 13 VHHs à 2 heures d'essais était de 4,59 avec les cellules SC et de 2,69 avec les cellules THP-1, la moyenne de la densité cellulaire était de 578 cellules/superficie de référence avec les cellules SC et de 367 cellules/superficie de référence avec les cellules THP-1 et la moyenne de l'approximation de la constante d'affinité apparente était de 110,19 x 10-2 avec les cellules SC et de 106,26 x 10-2 avec les cellules THP-1. Les VHH ont été répartis en groupes en fonction de leur spécificité et de leur approximation d'affinité. Six avaient une spécificité et une approximation d'affinité élevées (trois encore plus que le contrôle positif), cinq étaient spécifiques mais avaient une approximation d'affinité faible et deux avaient une spécificité et une approximation d'affinité faibles. Les VHH anti- CD105, les plus efficaces qui se lient avec une affinité et une spécificité élevées au CD105 en solution (sCD105) et sur les cellules (CD105 lié à la membrane), ont été proposés comme outils de détection du CD105 pour la recherche à la fois dans les études qui cherchent à mieux comprendre la fonction du CD105 in vitro et in vivo et dans l'application comme nanosondes pour le diagnostic et la thérapeutique des maladies dans lesquelles l'angiogenèse joue un rôle important.